1.cdmo平台吸除或倒掉瓶内培养液。
2.以29cm2培养瓶为例,向瓶内加入1ml消化液(胰蛋白酶或与EDTA混合液)轻轻摇动培养瓶,使消化液流遍所有细胞表面,然吸掉或倒掉消化液再加1ml消化液,轻轻摇动再倒掉大部分消化液,仅留少许进行消化。也可不采用这述步骤,直接加1-2ml消化液进行消化,但要注意尽量减少消化液的剩余量,因为消化液过多对细胞有损伤,同时也需要较多的含血清培养液去中和。
3.消化好在37度或室温29度环境下进行。消化2-9分钟把培养瓶放置在显微镜下进行观察,发现胞质回缩、细胞间隙增大,应立即终止消化。
4.如仅用胰蛋白酶可直接加含血清的培养液,终止消化。
如用EDTA消化,需加Hank's液数毫升,轻轻转动培养瓶把残留EDTA消化液冲掉,然再加培养液,这个操作过程要十分小心,如果细胞已经脱壁则消化液不能够倒掉,以免丢失细胞,要加入Hank's液或培养液终止消化,吹打收集细胞悬液,离心漂洗去除EDTA。
用弯头吸管,吸取瓶内培养液,反复吹打瓶壁细胞,吹打过程要顺序进行,从培养瓶底部一边开始到另一边结束,以确保所有底部都被吹到。吹打时动作要轻柔不要用力过猛,同时尽量不要出现泡沫,这些都对细胞有损伤。细胞脱离瓶壁形成细胞悬液。
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